動物源性食品中抗病毒類藥物殘留量測定的前處理方法
抗病毒類藥物主要包括金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、嗎啉胍等。金剛烷胺和金剛乙胺是第/一批被允許用來治療A型禽流感病毒的*藥，兩者都屬于穿入和脫殼抑制劑，抑制病毒的繁殖。研究發(fā)現(xiàn)，金剛烷胺可以引起角膜水腫，高劑量攝入時表現(xiàn)出一定的毒性。美金剛和金剛乙胺互為同分異構(gòu)體，但其性質(zhì)和作用機(jī)理卻并不相同。美金剛原被廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的治療，具有一定的神經(jīng)毒性。嗎啉胍又被稱為病毒靈，是一種廣譜抗病毒類藥物，對甲型和乙型流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞體病毒等有較好的治療效果，劑量過大會引起多汗、惡心、低血糖等不良反應(yīng)。我國在1999年12月將嗎啉胍列為禁用藥，2005年中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第560號公告將金剛烷胺、金剛乙胺、利巴韋林和嗎啉胍這4種抗病毒類藥物列為禁用獸藥，禁止用于動物生產(chǎn)。雖然抗病毒/藥屬動物禁用藥物，但其在動物養(yǎng)殖過程中依然被廣泛使用。若飼養(yǎng)者不科學(xué)、不合理地使用該類藥物，易導(dǎo)致藥物在畜禽機(jī)體內(nèi)殘留與富集，不僅會造成畜禽中毒，也會引起病毒耐藥毒株的出現(xiàn)，使抗病毒/藥物有效性降低，其耐藥性也有轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到人體的風(fēng)險(xiǎn)，對消費(fèi)者的健康存在很大的隱患。
本文闡述了如何將抗病毒類藥物從樣品基質(zhì)中分離提取出來，并經(jīng)過凈化后，轉(zhuǎn)化成液質(zhì)聯(lián)用儀可以檢測的形式。以提取、凈化為重點(diǎn)，依據(jù)行標(biāo)SN/T 4253-2015，為檢測人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。
檢測項(xiàng)目：金剛乙胺、金剛烷胺、美金剛、嗎啉胍、咪喹莫特、奧司他韋、阿昔洛韋
應(yīng)用范圍：雞肉、雞肉制品、豬肉、肝臟、魚、蝦、蛋、皮蛋等動物組織
方法原理：試樣中7種抗病毒類藥物用三氯乙/酸-乙腈混合溶液提取并沉淀蛋白，經(jīng)混合型陽離子交換固相萃取柱凈化后，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標(biāo)法定量。
前處理儀器：分析天平（感量0.1 mg和0.01 g）；組織搗碎機(jī)、高速冷凍離心機(jī)（4 ℃冷凍，18000 r/min）；離心機(jī)（5000 r/min）；渦旋混合器；pH計(jì)；氮吹儀；固相萃取裝置。
檢測儀器：HPLC-MS/MS+ESI源
試樣制備與保存
雞肉、肝臟、魚肉放在組織搗碎機(jī)均質(zhì)，充分混勻，均分成2份，分別裝入清潔容器內(nèi)，并標(biāo)明標(biāo)記；雞肉制品取雞肉部分；蛋、蝦去殼后取可食部分放在組織搗碎機(jī)均質(zhì)，充分混勻，均分成2份，分別裝入清潔容器中，并標(biāo)明標(biāo)記。
制樣操作過程中，應(yīng)盡可能防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。
試樣于-18 ℃以下保存，新鮮或冷凍的組織樣品可在2 ℃～6 ℃貯存72 小時。
前處理方法
稱取試樣5 g（精/確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入0.1 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.1 μg/mL），加入15 mL三氯乙/酸乙腈（90+10）溶液，加蓋后在超聲波發(fā)生器中超聲10 min，再旋渦混勻3 min，4 ℃條件下15000 r/min離心5 min，取出上清液，再加入10 mL三氯乙/酸乙腈溶液重復(fù)提取一次，離心后合并上清液至25 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度。
分別用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL2 %甲酸水溶液活化混合陽離子交換固相萃取小柱（60 mg，3 mL），準(zhǔn)確移取5 mL上清液加入到小柱中，依次用5 mL2 %甲酸水溶液和3 mL 1 %甲酸乙腈淋洗，棄去全部流出液；然后真空抽干小柱5 min，用4.0 mL洗脫溶液（氨水乙酸銨甲醇2.5+2.5+95）洗脫至10 mL玻璃管中，在50 ℃用氮?dú)鉂饪s儀吹至近干。準(zhǔn)確加入1.0 mL乙腈-甲醇-水溶液（70+10+20）溶解殘?jiān)?，渦旋30 s后過0.2 μm濾膜，供液質(zhì)測定。此樣液應(yīng)在48 h內(nèi)測定完畢。
注意事項(xiàng)
1.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別用甲醇配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，其中阿昔洛韋先用少量二甲基亞砜溶解，再用50 %甲醇水配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18 ℃避光保存，可使用6個月。
2.本方法使用了金剛烷胺D6、美金剛D6、阿昔洛韋D4同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行回收率的校正。
3.本方法使用三氯乙/酸-乙腈提取并沉淀蛋白，MCX固相萃取柱凈化。
4.MCX固相萃取柱的凈化過程是“酸上樣、堿洗脫”。淋洗后一定抽干小柱，防止水相進(jìn)入洗脫液。氨化洗脫液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，防止氨水揮發(fā)，導(dǎo)致目標(biāo)化合物洗脫不下來。
5.氮?dú)鉂饪s過程中，吹至近干潮濕狀態(tài)，定容后采取渦旋加超聲的方式復(fù)溶，可以提高回收率。
6.金剛烷胺的殘留檢測，有GB 31660.5-2019作為依據(jù)，應(yīng)根據(jù)需求進(jìn)行選擇使用。并注意其他藥物檢測方法的更新。
參考文獻(xiàn)
SN/T 4253-2015 出口動物組織中抗病毒類藥物殘留量的測定 液相色譜―質(zhì)譜/質(zhì)譜法
圖1 抗病毒類藥物殘留量測定的前處理流程圖
抗病毒類藥物標(biāo)準(zhǔn)品信息表
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